第二次划线之前灼烧：杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种来自上次划线末端。
2）灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。3）划线时最后一区域不要与第一区域相连。4）划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。
1）稀释操作时：每支试管及其中9mL水、移液管均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1－2cm处。2）涂布平板时：① 涂布器用70％酒精消毒，取出时，多余酒精在烧杯中滴尽，沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃。② 不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
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